تبلیغات
به سوی المپیاد زیست - اشنایی با PCR
به سوی المپیاد زیست
بدون عینك كنكور بهbiology فکرکنیم
صفحه نخست       پست الکترونیک          تماس با ما              ATOM            طراح قالب
گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من
درباره وبلاگ


من دانش آموخته کارشناسی ارشد رشته فیزیولوژی گیاهی از دانشگاه تهران هستم
هدفم در درجه اول ایجاد انگیزه در دانش آموزان رشته تجربی از طریق نگاهی نو به زیست شناسی است و راه اندازی کانونی برای علاقمندان به المپیاد زیست
دوست دارم از همکاران جوان و با انگیزه و آشنا به دانش روز زیست شناسی هم کمک بگیرم.
هیچ انگیزه مادی هم نداشته و ندارم. چون همیشه معتقدم غنی بودن و قانع بودن رمز رسیدن به کمال انسان است.
تا زمانی هم که وقت داشته باشم و دانش اموزان علاقمند هم وجود داشته باشند که منو تشویق کنند ادامه میدم.

مدیر وبلاگ :مدیر جون
مطالب اخیر
نویسندگان
نظرسنجی
نظر شما در باره تشکیل کلاس کنکوری زیست 1 برای سال سومی ها چیه؟ به شرطی که با مطالعه کامل و تست زدن در کلاس حاضر بشن و نکات ترکیبی و مفهومی کار بشه






PCR به علت دارا بودن ویژگی وحساسیت بالا وسرعت و سهولت آنT، جایگاه ویژه ای درتحقیقات و تشخیصهای مولکولی پیدا کرده است. PCR درسال۱۹۸۳ توسط دکتر Mullis  ابداع شد، که جایزه نوبل شیمی رادرسال۱۹۹۳ دریافت کرد.

PCR در محیط آزمایشگاه (in vitro) امکان تکثیر یک توالی معین ازDNA راکه بین دوتوالی مشخص قراردارد امکان پذیرمی کند تا DNA ازنظرمقدار به حد کافی برسد وبتوان روی آن آزمایشهایی مثل الکتروفورز-ژل آگارز- پلی اکریل آمید،هیبریداسیون با پروب راانجام داد.این روش ازنظرعلمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد. دکترMullis اولین بار ازآنزیمDNA پلیمراز اشریشیا کولی برای انجام PCR استفاده کرد.

کاربردPCR

تعین جنسیت جنین،تعیین ژنوتیپ اپیتوپهای پیوندی ،تعیین ژنوتیپ گروههای خونیABO ،تهیه نسخه های متعدداز یک ژن،تشخیص بیماریها واختلالات ژنتیکی ،تشخیص بیماریهای عفونی ،ردابوت وتعیین والدین مطالعات باستان شناسی ،تعیین انواع لوسمیها ،تولیدوطراحی واکسنهای انسانی ودامی ،پزشکی قانونی وانگشت نگاری،DNA ازروی لکه خشک شده خون ،درتشخیص HIV ،سل وبیماریهای مقاربتی.

درحقییقت این تکنیک می رود تا دراینده نتیجه گیری دادگاهها راتحت تأثیرقراردهد.

دانشمندان اکنون می توانند میکروارگانیسمهای غیرقابل کشتی راکه تا کنون نمی توانستند با روشهای کلاسیک میکروب شناسی مورد مطالعه قراردهند به کمک PCR مطالعه نمایند .

نمونه های مورداستفاده برای آزمایشگاه مولکولیPCR

طیف وسیعی ازمواد بیولوژیک ،لکه های خون،سرم،بزاق،منی ،مو ،مایع نخاعی ،استخوان، مایع آمنیون،سلولهای خودجنین درمرحله بلاستولا ،نمونه های بیوپسی ویا آتوپسی باشند هرچه آلودگی کمترباشد حساسیت ودقت نتایج بیشتر خواهد بود.

اصول وروشهای PCR

روش PCRبرمبنای سه روش ساده بنا شده که انجام این سه مرحله درهرواکنش سنتز DNA ضرورت داردکه با برنامه دادن به Thermocycler اجرا می شود وعبارتند از:

۱- مرحله Denaturation: دراین مرحله DNA هدف براثرحرارت تک رشته ای می شود،حرارت۹۰-۹۵ درجه سانتیگراد

۲- مرحله Annealing : دراین مرحله با کاهش حرارت سیستم ،پرایمرها درمحل مناسب روی رشته مکمل متصل می شوند ،دما۵۳-۷۵ درجه سانتیگراد، درمرحله Anneling بایددقت لازم بعمل آیدودما باید به درستی انتخاب شود این کار توسط کامپیوتر به طور مستقیم ویا توسط محقق وبا توجه به دانش فنی وتجربه صورت می گیرد اگردمای Annealing بدرستی انتخاب نشود احتمال تکثیر غیراختصاصی DNAوجوددارد به طوری که دردمای پایینتراز حداستانداردAmplication غیراختصاصی ودر دمای بالاتر ازمعمول عدم تکثیرDNA دخ می دهد.

۳ – مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای انزیم DNA پلیمراز مطلوب می باشد موجب توسعه پرایمرها شده وهمانندسازی DNA هدف انجام می گیرد.دما حدود۷۲ درجه سانتیگراد آنزیم مقاوم به حرارت Taq polymerase چهارتا نوکلئوتید dATP ، dGTP ،dTTP، dCTP موجود درمحیط وبافرهای PCR شامل Tris وپرایمرهای جفت شده به DNA را درحضورMgcl2 مورداستفاده قرار می دهد و واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می نماید وسبب طویل شدن رشته DNA جدیدی که توسط پرایمر ساخته شده است می شود .

نتیجه چرخه سه مرحله ای فوق سنتز دو مولکول جدیدDNA است ،سنتز DNA جدید به صورت تصاعدی آنقدر ادامه می یابد تا اینکه یکی ازمواد تشکیل دهنده محیط واکنش کاهش یابد وغیرفعال شود. به طورکلی حدود۳۵-۲۵ سیکل کافی است تا ازمقدار بسیارکم DNA صدها هزارنسخه DNA سنتز گردد. ازنظرتئوری بعداز۲۰ سیکل ۱میلیون وبعداز ۳۰سیکل ۱میلیارد کپی حاصل می گردد.نکته ای که درمراحل مختلف PCR بایدمورد توجه قرارگیرد زمان لازم برای رسیدن ازیک دما به یک دمای دیگرکه زمان کوتاهی است (Ramping Time).

پارامترهای مؤثر در PCR :

1- زمان ودمای Denaturation بستگی به تعداد C و G دارد

۲- دمای Annealing پرایمرها که باید۴-۳درجه کمترازدمای ذوب پرایمرها باشد

۳- زمان Primer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

۴- تعداد سیکلها

۵- Ramp (زمانی که طول می کشد تا دمای مبدادستگاه به دمای مقصد برسد)هرچه این زمان کمترباشد نتیجه کاربهتراست و واکنش زمان کمتری دردمای ناخواسته قرار می گیرد

۶- غلظت dNTP ها ویون منیزیوم(اینها مجموعه ای راتشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز می شوند وغلظت این دوماده تابعی ازیکدیگر می باشند)

۷- غلظت Template DNA (یک دهم تایک میکروگرم می باشد)چنانچه DNA هدف به صورت مالتی کپی درژنوم باشد بهتراست

۸- اضافه کردن تشدیدکننده های PCR

9- حذف مهارکننده های آنزیم ازمحیط

۱۰- بهتراست نقطه ذوب پرایمرها شبیه هم باشد(Tm یکسان داشته باشند)

طراحی پرایمر:

پرایمرهای PCR به صورت کاملاً اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظرDNA هدف طراحی میگردند.پرایمرها ۳۰-۲۰باز دارندوپرایمرهای بیش از۳۰بازاختصاصیت خوبی ندارند.همچنین پرایمرها بایددمای انیلینگ بالا داشته باشند.بهتراست تعدادبازهای دو پرایمر مساوی باشند واز پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند،همچنین نواحی تکرارشونده نداشته باشندچنانچه بازهای GیاC به صورت تکراری وپشت سرهم باشند پرایمربه صورت لوپ در می آید وعملاًسیستم کارنمی کند.نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند.بعداز طراحی پرایمربهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast انها را چک نمود تامشخص شود که با چه ژنهای دیگر می توانند Anneal گردند.

استخراجDNA ازخون:

۱- مقدار۱۰۰ میکرولیتر خون (خون لخته نشده باشد – برای کارهای PCR ازEDTA بعنوان ضدانعقاد استفاده شود زیرا مواد ضدانعقاد دیگر مهارکننده آنزیم پلیمراز میباشند)

۲- مقدار ۷۰۰ میکرولیترDNG ( ماده ای برای استخراج DNA که به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷درجه که این ماده معرف اصلی کیت می باشد )اضافه می کنیم

۳- به مدت ۱۵ثانیه آن را ورتکس می کنیم

۴- به مدت ۵دقیقه در دور ۳۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم

۵- سپس خون را از میکروتیوب به میکروتیوب دیگر انتقال می دهیم بدون اینکه لخته ها وارد شود

۶- به داخل خون ۵۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم سپس تکان می دهیم تا هاله سفیدرنگی تشکیل شود

۷- درفریز ۲۰- درجه به مدت ۲۰ دقیقه قرار می دهیم

۸- بعد از فریز به مدت۱۰ دقیقه در دور۱۳۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم

۹- محلول رویی را دور ریخته وبه لکه پایین cc1 اتانل ۷۵درصد اضافه می کنیم

۱۰- مقدار۵-۲ میکرولیتر آن را برای واکنش PCR استفاده می کنیم

استخراج DNA ازبافت:

۱ – مقدار۱۰۰ میلی گرم بافت توسط ازت مایع پودر می کنیم (به بافت ازت مایع اضافه می کنیم و

بوسیله هاون به هم می زنیم) واز این ۱۰۰ میکرولیتر بر می داریم وداخل میکروتیوب می ریزیم

۲ – ۴۰۰ میکرولیتر DNG به بافت اضافه می کنیم

۳- به مدت ۱۵ ثانیه ورتکس می کنیم

۴- ۳۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم

۵- یک لایه شیری رنگ تشکیل می شود که DNA است به مدت ۲۰ دقیقه داخل فریزر ۲۰- قرار می دهیم

بایدها ونبایدها در PCR :

1- آزمایش باید در محلی بدون رفت و آمد انجام گیرد

۲- سمپلرهای مورد استفاده نباید برای کارهای دیگر استفاده شوند ،ظروف لوله ها وسرسمپلرها اتوکلاو شوند وهنگام کار از دستکش استفاده شود( برای ممانعت ازعمل آنزیم DNase که سبب تخریب DNA هنگام استخراج DNA می شود وممانعت از عمل آنزیم RNase که سبب تخریب RNAهنگام استخراج RNA می شود) چون این دو آنزیم در محیط کار ودستها زیاد است

۳- هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کارتهیه کنید

۴- اعمال قبل وبعد PCR جدا از همدیگر انجام گیرد

۵- برای استفاده از هرماده از پیپت جداگانه واختصاصی استفاده کنید

۶- هنگام استفاده هرلوله را spin کنید تاموادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند جدا شده ورسوب کنند

۷- چندین کنترل منفی حین آزمایش Runکنید

۸- برای انجام آزمایشهای تاییدی از مواد فریز شده استفاده کنید

۹- همیشه DNA آمپلی فای شده راخارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید

۱۰- هنگام کار باPCR product مقداری از آن را جداگانه نگهدارید

موادی که برای PCR لازم است :

۱- بافرPCR – x10 (PCRدرحجم ۲۵یا۵۰ میکرولیترانجام می گیرد برای حجم ۲۵ میکرولیتر ۲٫۵میکرولیتربافرنیاز است

۲- DNTP(نوکلئوتیدها)۰٫۵میکرولیتر

۳- Mgcl2 1 میکرولیتر

۴- پرایمررفت ۱ میکرولیتر

۵- پرایمر برگشت ۱ میکرولیتر

۶- DNA 1 میکرولیتر

۷- آنزیم ۰٫۲ میکرولیتر

۸- آب مقطر ۱۷٫۸ میکرولیتر(مجموع مواد بالا منهای ۲۵ می شود ۱۷٫۸ که آب است)

بعد از ریختن مواد بالا در لوله های مخصوص PCR لوله ها را داخل Block دستگاه ترموسایکلر قرار دهید ودستگاه را روشن کنید (مقدار ۱۰۰ میکرولیتر روغن معدنی روی واکنش بریزید تا از بخار شدن مواد ممانعت بعمل آورد.لازم به ذکر است که دستگاههای ترموسایکلرجدید به صورت Heated lid ساخته شده اند یعنی درب دستگاه که روی لوله های واکنش قرار میگیرد حدود ۱۰۵ درجه گرم میشود در نتیجه بالای لوله گرمتر از پایین آن است واز بخار شدن مواد داخل لوله جلوگیری می شود ) پس از اتمام کار محصول آمپلی فای شده را با اگارز ۳درصد الکتروفورز کنید.





نوع مطلب :
برچسب ها :
لینک های مرتبط :
          
دوشنبه 5 خرداد 1393
چهارشنبه 1 شهریور 1396 01:47 ب.ظ
I know this web site offers quality depending articles or reviews and
additional material, is there any other website which gives these kinds of things in quality?
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر





آمار وبلاگ
  • کل بازدید :
  • بازدید امروز :
  • بازدید دیروز :
  • بازدید این ماه :
  • بازدید ماه قبل :
  • تعداد نویسندگان :
  • تعداد کل پست ها :
  • آخرین بازدید :
  • آخرین بروز رسانی :
امکانات جانبی


محمد رضا شجریان » آلبوم غوغای عشقبازان
دایرکتوری تبادل لینک
آگهی